Selección de una esterasa bacteriana con propiedades regioselectivas para la obtención de compuestos bioactivos

Resum

Las proteínas lipolíticas son enzimas ubicuas con importantes funciones fisiológicas en la síntesis o hidrólisis de compuestos que contienen grupos éster. Además, estas enzimas son valiosos biocatalizadores debido a su amplia especificidad de sustrato y su alta quimio-, regio- y estereoselectividad. Actualmente, la biocatálisis, y en particular el uso de enzimas hidrolíticas tales como esterasas, es una alternativa a los métodos de síntesis convencionales y puede ser útil para la protección y desprotección estereo- y regioselectiva de polifenoles y otros compuestos, abaratando y simplificando el proceso. En este trabajo se ha llevado a cabo la biotransformación de distintos compuestos fenólicos naturales procedentes del olivo como el hidroxitirosol, el alcohol protocatecuico y el 3,4- dihidroxifenilglicol y diferentes azúcares como la metil α-D-glucopiranósido, α,α-trehalosa y sacarosa mediante biocatálisis, con el fin de obtener derivados que posean una mayor biodisponibilidad y manteniendo las mismas propiedades antioxidantes que los polifenoles naturales de partida. La primera etapa de este trabajo consistió en la descripción de un método de selección de microorganismos lipolíticos a partir de muestras procedentes de diferentes industrias alimentarias. De los 459 microorganismos lipolíticos analizados, se seleccionó una bacteria identificada como Bacillus sp. HR21-6 para estudios posteriores. Esta cepa presentó las mejores tasas de conversión en las reacciones de desacetilación en los diferentes compuestos fenólicos y carbohidratos estudiados. En esta primera etapa, el sobrenadante liofilizado libre de células obtenido del cultivo de Bacillus sp. HR21-6 fue directamente utilizado como biocatalizador en la síntesis quimio y regioselectiva de compuestos parcialmente acetilados. El siguiente paso se centró en la identificación de la proteína implicada en las reacciones de acilación y desacilación de los compuestos polifenólicos y azúcares estudiados. Para ello, se obtuvo la secuencia completa de Bacillus sp. HR21-6, y después del análisis de su secretoma, se detectó una acetilesterasa (AE6L) en la fracción extracelular soluble (FESP). Esta enzima fue identificada como una carbohidrato esterasa, perteneciente a la familia II o GDSL, subfamilia SGNH. El gen que codifica la proteína AE6L fue clonado en el vector de expresión pMAB36 con una etiqueta 6xHis con el objetivo de expresar la enzima en células E. coli BL21 (DE3). AE6L se expresó totalmente en forma soluble, y su expresión se optimizó para proporcionar la cantidad máxima de enzima después de la purificación. La caracterización de esta enzima reveló que su mayor actividad se alcanza en la hidrólisis de compuestos de p-nitrofenol de cadena corta (C2). Su capacidad para realizar acilaciones y desacetilaciones regioselectivas sobre los compuestos fenólicos y azúcares analizados, demostró que al menos AE6L es una de las enzimas presentes en el sobrenadante, responsable de la actividad enzimática detectada, aunque pueden existir otras enzimas que participen, tal y como se sugiere en la discusión. En la siguiente etapa se llevó a cabo la caracterización molecular de los motivos de aminoácidos críticos de la enzima AE6L desde el punto de vista funcional, además de la construcción de diferentes mutantes con el objetivo de estudiar la influencia de ciertos aminoácidos en la actividad y en el comportamiento bioquímico de esta enzima. En la última etapa de este trabajo se estudió el potencial biológico y farmacológico de los derivados del hidroxitirosol y del DHPG con el fin de determinar su posible actividad antioxidante y antiinflamatoria. Se concluyó que estos derivados presentaron ligeras mejoras en determinadas actividades (antioxidante y anti-inflamatoria) sin producir efectos tóxicos para la célula.