Epithelial to mesenchymal transition in expanded human islet cells and redifferentiation in 3d culture system using a biomimetric synthetic scaffold

Resumen

La terapia celular de la diabetes está limitada por la escasez de células 13 disponibles para el trasplante. La expansión In vftro de células 13 humanas funcionales obtenidas de donantes de 6rganos cadavéricos es un enfoque prometedor para generar una fuente abundante de células productoras de insulina. Aunque las células 13 adultas pueden ser expandidas en cultivo monocapa, éstas llevan a cabo un proceso de transfcl6n epitelfo-mesenqufmal (EMT) perdiendo el fenotipo de células 13, así como la capacidad de producir insulina. Sin embargo, estas células 13 expandidas y desdlferenciadas podrían retener el potencial de ser redlferencladas de nuevo en células productoras de Insulina. Dado que la EMT ha sido identificada en otras células epiteliales humanas cultivadas en sistemas 2D, la hipótesis de trabajo del estudio 1 es que la EMT podría tener lugar también en las células endocrinas no-13 de los islotes tras ser expandidas In vitro. La presencia de este fenómeno en las células endocrinas no-13 podría tener implicaciones para el diseño de estrategias, con el objetivo de generar nuevas fuentes de células pro·ductoras de insulina. El proceso de EMT es una consecuencia de la disociación de fas células de los islotes en células individuales cuyo resultado es una alteración de los contactos célula-célula y célula-matriz. Tanto fa reagregaclón de estas células endocrinas expandidas como la restauración de la señalización de fas proteínas de la matriz extracelular (ECM) pueden ser pasos clave para la redlferenciaclón de las células de tipo mesenquimal hacia un fenotipo de células 13. Por tanto,•la hipótesis de trabajo del estudio 2 es que el restablecimiento de los contactos célula-célula y las relaciones célufa-ECM a través de un andamiaje 3D biomimético, como el proporcionado por las nanofibras de péptido autoensamblable (SAP}, podrla promover la rediferencfaclón de las células endocrinas humanas expandidas in vftr9 hacia un fenotipo de tipo de célula 13. Estudio 1. Los objetivos del primer estudio fueron Investigar si la EMT tiene lugar en las células endocrinas no-13 de Islotes pancreáticos humanos expandidos in vltro y determinar si la EMT puede prevenirse con la lnhlblci6n de la ruta de sefíalfzaclón del TGF-13, Los Islotes humanos aislados de donantes multiorgánicos se disociaron en células Individuales, se purificaron mediante un sorting de células por activación magnética y se cultivaron en monocapa. La co-expresión de Insulina y el marcador mesenqulmal vlmentlna fue identificada en el primer pase (pl), aumentando en pases posteriores (insulina+ vlmentlna+ 7,2 ± 6% a pl; 43 ± 15% a p4}. Las células endocrinas no-13 también co-expresaron vimentfna (glucag6n+ vlmentfna+ 59 ± 1.5% y 93 ± 6%, somatostatlna+ vlmentlna+ 16 ± 9.4% y 90 ± 10%, a pl y p4 respectivamente; PP+ vimentlna+ 74 ± 14% a pl; 88 ± 12% a p2). El porcentaje de células endocrinas que solo expresaban marcadores endocrinos se redujo progresivamente (0,6 ± 0,2% de células insulina+, 0,2 ± 0,1% glucagón+ y 0,3 ± 0,2% somatostatlna+ a p4; 0,7 ± 0,3% de células PP+ a p2). Los cambios en la expresión génica también apoyaron la presencia de EMT, encontrando una expresión reducida de marcadores endocrinos y el marcador epitelial CDH-1 (p <0.01), y aumento de la expresión de marcadores mesenquimales (CDH-2, SNAI2, ZEB1, ZEB2, VIM, NTSE y ACTA2; p<0,05). El tratamiento con el inhibidor de EMT, A83-01, redujo significativamente el porcentaje de células endocrinas que co-expresaban marcadores mesenqufmales, y preservó la expresión de marcadores endocrinos. En resumen, cuando los islotes humanos se dispersan en células individuales y se expanden en un cul􀀠lvo _monocapa, la EMT tiene lugar .tan_to. e􀀨.!􀀩s. ;élulas·13 como en l􀀰s c􀀲lulas señalizacion de tfg-b CON a83-01 apoya la aparición de EMT.