Estudio genético y molecular de mecanismos de resistencia a bilis en salmonella enterica

Resum

Este trabajo centra su investigación en las respuestas adaptativas de Salmonella enterica frente a situaciones de estrés. S. enterica tiene un ciclo de vida complejo y es capaz de sobrevivir y crecer en numerosos ambientes que incluyen, entre otros, una variedad de hospedadores animales así como múltiples entornos naturales. La versatilidad de esta especie bacteriana viene dada por su capacidad de desencadenar una respuesta apropiada a la variedad de señales ambientales que puede encontrar. Muchos de estos ambientes producen estreses a la bacteria en forma de limitación de nutrientes; pH, temperatura y osmolaridad inestables; desecación; exposición a péptidos antimicrobianos, bilis, agentes oxidantes, etc. Nuestra investigación está enfocada en la respuesta de la bacteria frente al estrés generado por exposición a bilis, una secreción digestiva con propiedades antimicrobianas. Durante su ciclo de infección, S. enterica entra en contacto con bilis en el intestino. La bilis es una secreción compleja, que tiene diversas funciones en la fisiología de los mamíferos. Sirve para la dispersión y absorción de lípidos durante la digestión, siendo secretada por la vesícula en el momento de ingestión de alimentos. La bilis también sirve para eliminar el exceso de colesterol y otros productos del metabolismo hepático. Adicionalmente, las sales biliares poseen potentes propiedades antimicrobianas: actúan como detergentes en la membrana lipídica, desnaturalizan proteínas y causan daños en el ADN, destruyendo la homeostasis bacteriana. Debido a estas propiedades, la capacidad de la flora intestinal y los patógenos entéricos para tolerar la bilis es muy importante para su supervivencia. En Salmonella, es igualmente importante para la subsecuente colonización del hospedador. Existen tres grandes mecanismos de resistencia a sales biliares en S. enterica. La primera barrera la constituye la envoltura celular, una estructura compleja con propiedades hidrofóbicas frente a múltiples sustancias antibacterianas incluyendo las sales biliares. La mayoría de los componentes de la envolura que proporcionan resistencia a bilis están en la cara externa de la envoltura celular, principalmente en el lipopolisacárido (LPS). Si las sales biliares logran penetrar en el citoplasma de la bacteria, el segundo mecanismo se activa: las bombas de vertido, que expulsan todo tipo de compuestos nocivos de la célula (incluyendo sales biliares, antibióticos, solventes, etc.). El último nivel de resistencia a sales biliares lo constituyen los mecanismos de evitación de daño a proteínas y a ADN, y los mecanismos de reparación de ADN. Un fenómeno de gran complejidad que tiene un papel importante en la resistencia a bilis por parte de S. enterica es la adaptación. Consiste en el aumento de la resistencia a bilis tras la exposición a una dosis subletal. Dicha resistencia, que permite sobrevivir a concentraciones letales de sales biliares, es reversible y desaparece una vez que la bacteria vuelve a encontrarse en ausencia de bilis. Aunque se conoce que la adaptación implica cambios en la expresión génica, aún sigue siendo un mecanismo poco entendido. Para identificar las funciones celulares esenciales para la adaptación a bilis, mutantes con fenotipos sensibles a bilis fueron sometidos a ensayos de adaptación. De este modo se observó que la bomba de vertido AcrAB parecía tener un papel esencial en la la adaptación a bilis. Un escrutinio genético en un mutante acrA determinó que únicamente el incremento de expresión de diferentes bombas de vertido podía restaurar parcialmente los niveles de resistencia a bilis en dicho mutante. Estos resultados llevaron a obtener múltiples mutantes carentes de de bombas de vertido y a estudiar su papel en la resistencia a bilis. La conclusión fue que, a pesar de que se ha indicado que existen 5 bombas de vertido que tienen sales biliares como sustrato, únicamente AcrAB era relevante. Estudios moleculares del proceso de adaptación mostraron que el primer contacto de cultivos de S. enterica en fase exponencial con sales biliares (DOC) conlleva un incremento de la expresión de acrAB. A su vez, estudios de citometría de flujo demostraron que en esta fase de crecimiento AcrAB permanece activa independientemente de la presencia de DOC. En fase estacionaria, la presencia de DOC no aumenta la expresión de acrAB pero activa el vertido por parte de esta bomba. Estas observaciones sugieren que la activación de la expresión de acrAB puede ser crucial durante las primeras etapas de adaptación, mientras que en fase estacionaria la actividad sostenida de estas bombas es suficiente para lograr elevados niveles de resistencia a bilis. Estudios de mecanismos de resistencia a bilis in vivo, utilizando ratones BALB/c como modelo de fiebre tifoidea, llevaron a la conclusión de que la colonización de la vesícula biliar depende principalmente del proceso de adaptación a bilis de S. enterica. Esta conclusión se obtuvo al observar que en la gran mayoría de aislados de la vesícula la resistencia a bilis desaparecía una vez que dichos aislados eran cultivados en un medio libre de sales biliares. Sin embargo, también se obtuvieron algunos aislados con resistencia estable, que fueron considerados mutantes. Los genomas de algunos de dichos aislados fueron secuenciados. Los resultados confirman que la envoltura celular bacteriana es la principal estructura mediadora de resistencia a bilis en S. enterica: la mayoría de aislados presentaban mutaciones en genes relacionados con las membranas, la división celular, el transporte, la síntesis de LPS, etc. Debido a las implicaciones médicas que puede tener la resistencia a bilis de S. enterica, el estudio de los mecanismos de interacción bacteria--‐bilis presentado en esta Tesis puede contribuir a desarrollar nuevos enfoques terapéuticos para erradicar la infección crónica de la vesícula biliar por parte de Salmonella, que constituye un serio problema sanitario en determinadas regiones del planeta.