Uso de líneas celulares como modelos in vitro para la evaluación de toxicidad y mecanismos de acción de contaminantes ambientales

Resumen

En esta tesis se investiga la utilidad de diferentes bioensayos basados en el uso de líneas celulares (peces/humanas) y fracciones subcelulares, para la caracterización del riesgo ambiental que diversos contaminantes orgánicos comportan tanto para los ecosistemas acuáticos como para la salud humana, con especial énfasis en disruptores endocrinos y ligandos de receptores celulares implicados en la biotransformación de xenobióticos. Por un lado, en este trabajo se caracteriza la calidad ambiental de sedimentos marinos costeros de diferentes áreas del Mar Mediterráneo, Mar Negro, estuario del Algarve, Bahía de Paraguaná (Brasil) y Mar de Weddell (Antártida), mediante una batería de bioensayos in vitro, basada en el uso combinado de la línea celular PLHC-1 (para determinar citotoxicidad, generación de estrés oxidativo e inducción CYP1A), células COS-7 transfectadas con el receptor zfPxr (detección de agonistas de zfPxr), y fracciones microsomales de ovario de lubina (Dicentrarchus labrax) (detección de agentes disruptores endocrinos capaces de inhibir la actividad del enzima P450 aromatasa). Los resultados obtenidos han permitido clasificar las áreas marinas según su nivel de presión antropogénica. Entre las áreas marinas estudiadas, destacan los puertos, las desembocaduras de grandes ríos (Danubio y Po), y la Bahía de Kaštela, como las más impactadas. Destacar así mismo la presencia de agonistas de AhR en los sedimentos de zonas remotas situadas en la Antártida, que se creían relativamente limpias de contaminantes antropogénicos. Por otro lado, se investiga la toxicidad de diferentes contaminantes emergentes, incluyendo ftalatos, bisfenol A, alquilfenoles y compuestos perfluorados, evaluando su capacidad de actuar como disruptores endocrinos y de alterar la composición lipídica en las células de placenta humana JEG-3, prestando especial atención a la biodisponibilidad de los compuestos en el medio de cultivo. Entre los contaminantes investigados, los alquilfenoles mostraban mayor citotoxicidad y potencial de disrupción endocrina, particularmente 4-dodecilfenol (DP), seguido de 4-nonilfenol (NP), 4-ter-octilfenol (OP), 4-heptilfenol (HP) y 2,4,6-tri-ter-butilfenol (TTBP). La toxicidad de los alquilfenoles estaba asociada a su hidrofobicidad, de manera que los compuestos con un coeficiente log Kow mayor, eran los más tóxicos. La capacidad de los alquilfenoles de cadena larga DP, OP y NP, de inducir la actividad P450 aromatasa en un rango de concentraciones tan reducido (10-30 µM) y tan cercano a su citotoxicidad, evidencia la necesidad de diseñar los ensayos de exposición con factores de dilución de la muestra lo suficientemente bajos, para facilitar la detección de estas respuestas. Los compuestos perfluorados PFOS, PFOA y PFBS, inhibían la actividad P450 aromatasa, con IC50 en el rango de 57 a 80 µM. Esto es de particular relevancia dado que, debido a su menor toxicidad, perfluorobutanosulfonato (PFBS) se está utilizando como sustituto de ácido perfluorooctanosulfonato (PFOS) y ácido perfluorooctanoico (PFOA). Los contaminantes NP, OP y dibutil ftalato (DBP) modulaban la actividad P450 aromatasa en células de placenta a concentraciones ambientalmente relevantes (5-40 µM), detectadas en cordón umbilical de bebés nacidos con problemas de poco peso. La aparente insensibilidad de las células JEG-3 a la exposición a ftalatos estaba asociada a su elevada hidrofobicidad y baja solubilidad en el medio de cultivo. Esto hace necesario determinar las concentraciones experimentales frente a las dosis teóricas en el medio de cultivo, para así no subestimar la toxicidad de estos compuestos. Los análisis químicos han permitido la detección de alteraciones en el perfil lipídico de células de placenta humana tras exposición a alquilfenoles. La exposición a DP y TTBP a concentraciones de 10 y 20 µM, respectivamente, inducían la acumulación de triacilglicéridos en dichas células, mientras que 20 µM de HP reducía significativamente las especies lipídicas más poliinsaturadas, las más susceptibles a oxidación. Dicho efecto, junto con la elevada respuesta observada en el ensayo de estrés oxidativo, sugieren que HP promueve la peroxidación lipídica en las células de placenta.