Análisis de la función y la regulación de ArfGAP1

Resumen

Una de las características más significativas de la célula eucariota es el incesante tráfico vesicular que acontece entre sus orgánulos. A pesar de ello, y con el fin de mantener su propia identidad, cada compartimento consigue retener sus componentes endógenos. No obstante, ocasionalmente moléculas autóctonas abandonan un orgánulo, existiendo mecanismos encaminados a su recuperación. En este sentido, el transporte entre compartimentos es siempre bidireccional. Cada etapa del transporte viene catalizada por un conjunto de proteínas clave que constituyen la maquinaria molecular del mismo. Entre los elementos más relevantes de esta maquinaria se encuentran los complejos citosólicos de cubierta, encargados de generar las vesículas, seleccionar las moléculas cargo a transportar e incluso determinar su destino final. En el tráfico bidireccional reticulo---Golgi operan dos tipo de cubiertas: COPII, que media el transporte anterógrado, y COPI, responsable del transporte retrógrado. Arf1 es una pequeña GTPasa, esencial en la formación de las vesículas COPI. La actividad de Arf1 depende de proteínas auxiliares como los factores GEF que la activan ó como las proteínas GAP responsables de su inactivación. ArfGAP1, la forma molecular mayoritaria, posee propiedades biológicas y requerimientos funcionales diferentes a las isoformas ArfGAP2 y ArfGAP3. Aunque son numerosos los estudios realizados sobre ArfGAP1, no está claro su papel en el tráfico mediado por vesículas COPI. Es más, recientemente se ha descrito que podría participar en otras funciones celulares ajenas al transporte vesicular. Así, parece estar implicada en el mantenimiento y organización del citoesqueleto de actina y en la traducción de señales como las encargadas de activar la vía Wnt/?---catenina. Durante el presente estudio hemos pretendido profundizar en el conocimiento funcional de ArfGAP1. Asimismo, hemos abordado su regulación a nivel molecular. Los resultados obtenidos indican que la mayor parte de la proteína se encuentra localizada en el complejo de Golgi y en el compartimento intermedio retículo endoplasmico---Golgi. Dado que estas estructuras son lugares de partida para el tráfico retrógado de recuperación de componentes endógenos del retículo, nuestras observaciones ponen de manifiesto la implicación de ArfGAP1 en tal vía mediada por vesículas COPI. Por otro lado, según las observaciones derivadas de la sobreexpresión de ArfGAP1, pensamos que su actuación podría ser dual. Por un lado favorecería la formación de las vesículas y, por otro, llevaría a cabo un efecto antagónico al inducir el desprendimiento de la cubierta COPI. A pesar de ello, ArfGAP1 no parece ser un factor imprescindible para el tráfico bidireccional reticulo---Golgi, pues en su ausencia el transporte continúa en ambos sentidos. Posiblemente las formas moleculares ArfGAP2 y ArfGAP3 podrían reemplazarla funcionalmente. Al menos así ocurriría nivel del complejo de Golgi, pues, a diferencia de ArfGAP1, tanto ArfGAP2 como ArfGAP3 se hallan ausentes del compartimento intermedio reticulo--- Golgi. Hemos determinado que una parte significativa de las moléculas de ArfGAP1 se localizan normalmente en el interior del núcleo celular y ello supone la posibilidad de averiguar nuevos papeles funcionales para esta proteína. Además, hemos comprobado que existen dos variantes moleculares de ArfGAP1, que difieren en tamaño y modificaciones post---traduccionales. A tenor de los resultados obtenidos, la de menor peso molecular se encuentra en el núcleo, mientras que la de mayor tamaño se localiza preferentemente en el citoplasma. Ambas están fosforiladas y, además, la de mayor peso se encuentra ubiquitinada. El análisis de la fosforilación experimentada por ArfGAP1 nos ha permitido identificar a un residuo de serina ubicado en posición 360 como lugar preferente de fosforilación. Este aminoácido está altamente conservado en vertebrados y, al encontrarse muy próximo al extremo C---terminal, podría estar implicado en la interacción con otras moléculas. Finalmente, nuestros resultados indican que la enzima responsable de tal fosforilación es la quinasa dependiente de AMPc (PKA).