Adaptation to bile in Salmonella enterica.

Resumen

Las bacterias pertenecientes al género Salmonella son patógenos Gramnegativos capaces de infectar una gran variedad de animales. En humanos, la infección por Salmonella suele comenzar con la ingestión de agua o alimentos contaminados, y puede dar lugar a diferentes cuadros clínicos que van desde gastroenteritis hasta fiebre tifoidea. Durante la infección, Salmonella se ve expuesta a una serie de condiciones desfavorables a las que debe responder para sobrevivir. Un factor adverso, tanto en el intestino como en la vesícula biliar, es la presencia de bilis. La bilis es una secreción digestiva compuesta mayoritariamente por sales biliares, que ayudan a la digestión degradando y dispersando lípidos. Además, las sales biliares tienen actividad antimicrobiana: actúan sobre los fosfolípidos de la membrana celular a modo de detergente, desnaturalizan proteínas y producen daños en el ADN. A pesar de sus efectos nocivos, Salmonella es intrínsecamente resistente a la bilis, e incluso es capaz de crecer formando biofilms sobre la superficie de los cálculos biliares en el interior de la vesícula biliar. Igual que sucede con otras sustancias antimicrobianas, Salmonella puede adaptarse a la bilis: en presencia de concentraciones subletales de bilis, aumenta su nivel de resistencia. El objetivo de esta Tesis ha sido el estudio de los mecanismos implicados en la resistencia de Salmonella enterica a la bilis, con énfasis en el fenómeno de la adaptación. En primer lugar se realizó un análisis transcriptómico en presencia de concentraciones subletales de desoxicolato (DOC), la sal biliar más abundante en la bilis. Los resultados de dicho análisis mostraron cambios en la expresión de un gran número de genes. Algunos cambios significativos eran los siguientes: 1. Activación de la respuesta general a estrés dependiente de RpoS y de otras respuestas a estrés. 2. Represión de genes de porinas y de otros genes que codifican proteínas de la envuelta bacteriana. 3. Activación de bombas de vertido. La adaptación no es el único mecanismo que confiere resistencia a bilis en Salmonella. Al sembrar un cultivo de Salmonella en una placa que contiene una concentración letal de bilis se obtienen colonias resistentes, y el análisis de fluctuación indica que dichos aislados proceden de células resistentes existentes en el cultivo previo. Una fracción de aislados resistentes son, como cabía esperar, mutantes. La secuenciación completa del genoma de 6 mutantes independientes reveló la existencia de diversos tipos de mutaciones, pero el tipo más común estaba relacionado con transporte de lipopolisacárido. La causa por la que mutaciones en los genes de transporte de lipopolisacárido confiere resistencia a bilis se desconoce. Entre los aislados resistentes a bilis obtenidos con selección letal apareció un segundo tipo, a priori inesperado. Se trataba se aislados que perdían la resistencia a bilis si se cultivaban en ausencia de DOC (por ejemplo, en LB). La inestabilidad del fenotipo de resistencia descartaba que la resistencia se debiera a mutación. Una explicación plausible es que los aislados con resistencia inestable procedan de células que, durante el cultivo previo, habían activado accidentalmente alguna de las respuestas a estrés que confieren resistencia a bilis. Esta hipótesis es apoyada por el análisis de células individuales usando microscopía microfluídica: los cultivos de S. enterica en LB contienen células que tienen activada la respuesta general a estrés y otros loci de respuesta a estrés. Este patrón de expresión permitiría posteriormente la formación de colonias en placas con una concentración letal de bilis. Esta hipótesis es coherente con múltiples observaciones, realizadas por otros autores y también en nuestro laboratorio, en el sentido de que las poblaciones bacterianas clonales pueden ser fenotípicamente heterogéneas para determinados caracteres. Entre los genes activados por bilis identificados mediante análisis transcriptómico se encontraba un gen de función desconocida anotado como yiiU. La pérdida de función de yiiU producía sensibilidad a bilis. El análisis in silico indicó que dicho gen era homólogo del gen zapB de E. coli, que codifica un factor no esencial de división celular. El análisis de complementación indicó que los genes zapB de E. coli y S. enterica son intercambiables. Por su parte, el análisis microscópico de células individuales reveló que la proteína ZapB de Salmonella, como la de E. coli, se localiza en el septo. Se desconoce la causa por la que la falta de ZapB causa sensibilidad a DOC, pero es concebible que la ausencia de anillo preseptal altere la estructura de la envuelta bacteriana haciéndola más susceptible a las sales biliares. Usando fusiones lacZ y analizando los niveles de ARNm por Northern se confirmó que el gen zapB de Salmonella es activado por DOC. Ahora bien, la regulación por DOC no parece ser transcripcional, ya que se sigue observando cuando zapB se coloca bajo el control de un promotor heterólogo (pLtetO). El análisis de la estabilidad del ARNm zapB mediante Nothern indicó que el ARNm zapB era más estable en presencia de DOC, y una mutación hfq eliminaba dicho aumento. Estas observaciones sugieren que, en presencia de DOC, un mecanismo postranscripcional dependiente de Hfq impide la degradación del ARNm de zapB. No se puede descartar que la unión de Hfq proteja al ARNm zapB de la degradación. Ahora bien, dado que Hfq habitualmente actúa catalizando la interacción entre moléculas de ARN, parece más probable que el aumento de estabilidad del ARNm de zapB en presencia de DOC se deba a la interacción con un ARN pequeño regulador (sRNA). Dos candidatos son los sRNAs OxyS y RprA, cuya síntesis aumenta en presencia de bilis. Pese al aumento de estabilidad del ARNm de zapB en presencia de DOC, la cantidad de proteína ZapB disminuye en presencia de DOC. Una mutación lon suprime el fenotipo de inestabilidad proteica, y ello sugiere que la proteasa Lon degrada la proteína ZapB en presencia de DOC. Este fenómeno puede interpretarse suponiendo que el DOC daña la proteína ZapB, ya que una de las actividades de la proteasa Lon es la degradación de proteínas anómalas. Así como la sensibilidad a bilis por carencia de ZapB sugiere que la integridad del septo es necesaria para la resistencia a bilis, el estudio de un mutante hiperresistente a bilis proporcionó indicios de que la estructura de la pared celular también tiene un papel en la resistencia a bilis. Dicho mutante carecía de proteasa periplásmica Prc, una proteína implicada en el procesamiento de PBP3. En ausencia de Prc se detectan cambios en la actividad de PBP3 y de otras proteínas de síntesis de péptidoglicano, y ello sugirió una posible correlación entre la estructura del péptidoglicano y la resistencia a bilis. El análisis de la estructura del péptidoglicano en presencia de una concentración subletal de DOC mostró una disminución en la cantidad de lipoproteína de Braun anclada covalentemente al péptidoglicano y una disminución de los muropéptidos entrecruzados mediante enlaces 3-3. El análisis de la estructura del péptidoglicano en presencia de una concentración letal de DOC (tras adaptación previa del cultivo) mostró cambios similares. Ello sugiere que la presencia de DOC induce una remodelación del péptidoglicano, y que dicha remodelación contribuye a la resistencia a bilis. Esta hipótesis es apoyada por observaciones adicionales: (i) un triple mutante carente de las L,D transpeptidasas YbiS, ErfK, and YcfS, que no contiene lipoproteína de Braun unida covalentemente al péptidoglicano, resultó ser hiperresistente a bilis; (ii) la superproducción de L,D transpeptidasa YnhG, que produce un aumento de los enlaces 3-3, disminuye la resistencia a bilis. Por tanto, parece razonable añadir la remodelación de la pared celular a la lista de respuestas celulares que permiten la adaptación de Salmonella enterica a la bilis.