Cultivos celulares de nicotiana tabacum L.cv.BY-2 como sistema modelo en el estudio de la adaptación al estrés salino.

Resum

RESUMEN El objetivo general de esta tesis doctoral es ampliar los conocimientos sobre los mecanismos que permiten la adaptación de los cultivos celulares de Nicotiana tabacum cv. BY-2 al estrés abiótico, concretamente estrés salino. Para ello, hemos establecido como objetivos específicos los siguientes: 1. Estudiar diferentes mecanismos fisiológicos, bioquímicos y celulares de adaptación a salinidad. 2. Estudiar el papel que desempeñan las giberelinas (GAs) en el proceso de adaptación a salinidad. 3. Estudiar la implicación de las proteínas ricas en arabinogalactanos (AGPs) y extensinas (EXTs) en el proceso de adaptación a salinidad. El desarrollo de estos objetivos se ha llevado a cabo mediante la utilización de técnicas bioquímicas, celulares y de biología molecular que nos han permitido obtener una visión más integrada de los mecanismos implicados en la adaptación de las células vegetales al estrés salino mediante la regulación hormonal de los cambios en la estructura y composición de la pared celular. De entre las técnicas empleadas podemos destacar la microscopía óptica, electrónica y confocal, la transcriptómica, proteómica e ionómica y la inmunolocalización mediante el uso de anticuerpos monoclonales. Como conclusiones del trabajo podemos indicar que: 1. Las células de tabaco BY-2 adaptadas a altas concentraciones salinas mostraron importantes modificaciones en la estructura subcelular. En función de la fase de crecimiento en la que se encontraban, estas células presentaron un tamaño de dos a cuatro veces menor que las células crecidas en condiciones control. 2. Las células de tabaco BY-2 adaptadas a altas concentraciones salinas mostraron importantes diferencias ultraestructurales al ser comparadas con las células crecidas en condiciones control. Estas diferencias se debieron principalmente a las modificaciones inducidas por la muerte celular observada en las células adaptadas. 3. El proceso de adaptación a altas concentraciones salinas produce importantes modificaciones en el proteoma y transcriptoma de las células de tabaco BY-2. 4. La adaptación a altas concentraciones salinas induce la compartimentación de Na+ y el tráfico de vesículas en células de tabaco BY-2. 5. El metabolismo de la prolina y del ABA están implicados en el proceso de adaptación a altas concentraciones salinas en células de tabaco BY-2. 6. La producción de ROS en la mitocondria puede actuar como modulador en el proceso de adaptación a altas concentraciones salinas en células de tabaco BY-2. 7. El sistema de endomembranas, retículo endoplasmático y aparato de Golgi son modificados en el proceso de adaptación a salinidad en células de tabaco BY-2. 8. Los cultivos celulares de tabaco BY-2 adaptados a salinidad contienen una menor concentración de giberelinas bioactivas y son sensibles a prohexadiona. 9. La expresión de los genes de síntesis y degradación de GAs está regulada de forma diferencial en las células de tabaco BY-2 adaptadas a salinidad. 10. Las células de tabaco BY-2 adaptadas a salinidad acumulan AGPs en el medio extracelular, posiblemente debido a una mayor tasa de recambio en la membrana plasmática. 11. Las células de tabaco BY-2 adaptadas a salinidad muestran una distribución diferencial de AGPs en el citoplasma, membrana plasmática y tonoplasto en comparación con las células control. 12. El reactivo de Yariv induce la muerte celular en las células de tabaco BY-2 control, pero no en las células adaptadas a salinidad. 13. Las células de tabaco BY-2 adaptadas a salinidad acumulan extensinas en el medio extracelular, lo que podría estar relacionado con una respuesta de defensa frente al estrés. SUMMARY The aim of this thesis is to enhance our knowledge about the mechanisms of the cell line Nicotiana tabacum BY-2 to the stress conditions, in particular to high salinity stress. We have proposed the following specific objectives: 1. Study different physiological, biochemical and cellular mechanisms for adaptation to high salinity. 2. Analyze the putative changes in the GAs metabolism under the salinity stress conditions and how these changes may affect the plant cells adaptation. 3. Study the involvement of arabinogalactans proteins (AGPs) and extensins (EXTs) in the adaptation process to high salinity. The development of these objectives has been carried out using biochemical, cellular and molecular biology tools. These methods have allowed us to obtain a more integrated view of the mechanisms involved in the adaptation of plant cells to salt stress by regulating hormone changes in the structure and composition of the cell wall. We have been successfully used light, electronic and laser confocal microscopy, transcriptomic, proteomic and ionomic techniques and specific monoclonal antibodies. We suggest the following conclusions: 1. Tobacco BY-2 cells adapted to high salinity showed significant changes in their subcellular structure. The cellular volume was 2-4 fold smaller in adapted cells. 2. Tobacco BY-2 cells adapted to high salinity showed relevant ultrastructural differences compared with cells grown in control conditions. These differences were mainly due to the modifications induced by cell death observed in adapted cells. 3. The adaptation process to high salinity produces significant changes in the proteome and transcriptome of tobacco BY-2 cells. 4. Adaptation to high salinity induces the Na+ compartimentation and vesicle trafficking in tobacco BY-2 cells. 5. Proline metabolism and ABA are involved in the process of adaptation to high salinity in tobacco BY-2 cells. 6. ROS production in mitochondria can act as a modulator in the adaptation process to high salinity in tobacco BY-2 cells. 7. Endomembrane system, endoplasmic reticulum and Golgi apparatus are modified in the process of adaptation to salinity in tobacco BY-2 cells. 8. Cell cultures of BY-2 adapted to high salinity contain a lower concentration of bioactive gibberellins and are sensitive to prohexadione compared to control cells. 9. The GAs gene expression of synthesis and degradation is differentially regulated in tobacco BY-2 cells adapted to high salinity. 10. Tobacco BY-2 cells adapted to high salinity accumulate AGPs in the extracellular medium, possibly due to higher turnover rate in the plasma membrane. 11. Tobacco BY-2 cells adapted to high salinity exhibit differential AGPs distribution in the cytoplasm, plasma membrane and tonoplast, compared to control cells. 12. Yariv reagent induces cell death in tobacco BY-2 control cells, but not in cells adapted to high salinity. 13. Tobacco BY-2 cells adapted to high salinity accumulate extensins in the extracellular medium, which could be related to a defense response to stress.