Sistemas de detección ultrasensible de moléculas de distinta naturaleza para la detección temprana del cáncer

Resumen

1. Introducción o motivación de la tesis. En las últimas décadas, los inmunoensayos han jugado un papel significativo en el análisis biológico en diferentes ámbitos como son el diagnóstico clínico [1], el análisis biofarmacéutico [2 y 3], el monitoreo medioambiental de herbicidas, fungicidas e insecticidas [4], así como la seguridad y la alimentación [5]. Entre los inmunoensayos, la técnica ELISA es utilizada ampliamente en clínica para la detección de biomarcadores en el seguimiento y detección de enfermedades debido a su alta especificidad, sensibilidad, precisión y trazabilidad [6]. La cuantificación y detección de biomarcadores en enfermedades como el cáncer, permite la evaluación de riesgos, el cribado, el diagnóstico diferencial, la determinación del pronóstico, la predicción de la respuesta al tratamiento y el seguimiento de estas [7]–[9]. Debido al papel fundamental que tiene la detección y cuantificación de analitos relacionados con las enfermedades, ha sido importante el desarrollo de sistemas que sean simples, de bajo coste, y que puedan proporcionar una estimación sensible y específica de dichas moléculas. Sin embargo, no siempre los ensayos ELISA tienen la sensibilidad necesaria para la detección de biomarcadores en los primeros estadios del cáncer. La sensibilidad de un ELISA depende de parámetros como la interacción entre el antígeno y el anticuerpo, la temperatura, el pH y la eficacia de la unión del anticuerpo a la superficie de ensayo. Entre estos factores, la inmovilización del anticuerpo en el sustrato (generalmente de poliestireno) juega un papel crucial en la mejora del límite de detección [10]. Se ha demostrado a través de varias plataformas diagnósticas, que una mayor densidad de anticuerpos en la superficie mejora la sensibilidad de la detección, por lo cual han sido desarrolladas diferentes estrategias para inmovilizar adecuadamente las proteínas a las superficies [11 y 12]. El método más simple de inmovilización de un anticuerpo a una superficie sólida como el poliestireno, es mediante adsorción física, la cual ocurre debido a interacciones hidrofóbicas, fuerzas de van der Waals e interacciones π-π y electrostáticas [13]. La adsorción pasiva de los anticuerpos es el método más empleado para el desarrollo de inmunoensayos clínicos y de investigación, así como para la preparación de partículas de oro con fines farmacológicos o diagnósticos [14]. La inmovilización pasiva generalmente da como resultados que los anticuerpos queden orientados al azar, pierdan su conformación nativa y en algunos casos su actividad. Además, los anticuerpos pueden experimentar desplazamiento sobre las superficies debido a los sucesivos pasos de lavados requeridos de los diferentes ensayos [15 y 16]. La unión covalente de los anticuerpos de captura a la superficie asegura una robusta inmovilización de estos, mejorando de esta manera su densidad y evitando su pérdida durante los pasos consecutivos del ensayo. Muchos de los enlaces covalentes formados entre los anticuerpos y la superficie, se basan en la generación de grupos amino, carboxilo y epoxi sobre la superficie mediante diferentes métodos. Posteriormente, el anticuerpo se une a estos grupos mediante reacciones químicas usando compuestos hetero u homo bifuncionales a través de sus grupos NH2 y COOH [17]. Por otra parte, la orientación que resulta predominante de la inmovilización de los anticuerpos a una superficie, mantiene los sitios de unión del anticuerpo al antígeno sobre esta, de forma que el anticuerpo no puede interaccionar con el antígeno adecuadamente [18]. La obtención de soportes que proporcionen una adecuada orientación de los anticuerpos permite un aumento significativo de la sensibilidad de los ELISAs comparados con su inmovilización al azar. Con este fin se han utilizado proteínas que se unen específicamente a los anticuerpos como la proteína G, la proteína A o la proteína L [15 y 19]. 2. Contenido de la investigación. En este trabajo hemos desarrollado dos estrategias de inmovilización de anticuerpos a un sustrato sólido con el fin de aumentar la sensibilidad en el ensayo ELISA. En una de las estrategias hemos involucrado la reacción de alta eficiencia y especificidad entre la tetracina y el trans-cicloocteno (TCO) con el fin de aumentar la densidad del anticuerpo en la superficie; y en la otra, la afinidad del dominio de unión a quitina por su sustrato como método para lograr la correcta orientación del anticuerpo inmovilizado. Para la primera estrategia se prepararon superficies con tetracina, mientras que el anticuerpo fue modificado con TCO. La preparación de las superficies se llevó a cabo de tres formas diferentes: 1) partiendo de placas aminadas comerciales tratadas con glutaraldehído y lisina para aumentar el número de grupos NH2 en superficie, 2) partiendo de placas aminadas mediante un proceso de química en mojado y 3) recubriendo placas MaxiSorp con la proteína BSA marcada con 20 tetracinas por molécula. Para la evaluación de las superficies se utilizaron tres modelos de ELISA, dos de ellos recubriendo con el anticuerpo de baja afinidad anti c-myc (9E10) marcado con TCO, donde se detecta la proteína c-myc-GST-IL8h o c-myc-IL6h, y como anticuerpo de detección el específico para la citoquina correspondiente. El otro ELISA, para la evaluación de las superficies, se utilizó para detectar la proteína CEA, relacionada con el diagnóstico del cáncer colorrectal. En todos los casos se observó un aumento de la sensibilidad del ELISA desarrollado en las superficies preparadas con tetracina comparado con la superficie estándar. En la detección de c-myc-GST-IL8h se obtuvo un aumento de sensibilidad del ELISA, comparado con las superficies estándar, de 2,6 veces para las superficies preparadas a partir de placas aminadas comerciales, de 11 veces partiendo de placas aminadas mediante química en mojado y de 13,7 veces en placas previamente recubiertas con BSA-tetracina. Del mismo modo, en el ELISA de detección de c-myc IL6h se aumentó la sensibilidad 9 veces en placas con tetracina a partir de placas aminadas mediante química en mojado y, por último, el ELISA de detección de CEA tuvo un aumento de 12 veces en placas previamente recubiertas con BSA-tetracina. En la segunda estrategia fueron preparadas superficies de poliestireno con quitosano acetilado mediante un proceso de acetilación in situ mientras que, por otro lado, fue preparado el anticuerpo anti cmyc (9E10) unido a ChBD. Esta unión fue realizada de forma química a través de una reacción de tipo química clic y de forma recombinante fusionando ChBD al carboxilo terminal del anticuerpo. Ambos anticuerpos fueron evaluados mediante el ELISA de detección de la proteína c-myc-GST-IL8h, en las placas de quitosano acetilado, observándose un aumento de la sensibilidad de 6 veces con respecto al ELISA realizado en la superficie estándar usando el anticuerpo obtenido de forma recombinante. Asimismo, se diseñó un método de detección de dos moléculas de distinta naturaleza en un ensayo tipo multiplex de spot en placas de ELISA. El objetivo fue determinar la concentración de dos moléculas relacionadas con el cáncer colorrectal, el miRNA-29b y la proteína CEA. Para la detección del miRNA mediante un ensayo inmunoenzimático, se desarrolló un método directo de hibridación in situ y otro basado en la técnica PCR-ELISA. Con esta última técnica de detección de ácidos nucleicos se logró la detección del miRNA-29b con un límite de detección (LOD) de 1358 moléculas totales simultáneamente con la proteína CEA, con un LOD de 2,54 ng/ml. 3. Conclusión. En este trabajo se demuestra a través de la reacción tetracina - TCO, que la sensibilidad del ensayo ELISA mejora de forma significativa usando un sistema de inmovilización de anticuerpos que permita que estos queden fijados mediante un enlace covalente a la superficie. Además, la correcta orientación de los anticuerpos en la superficie de un ensayo de ELISA mejora la sensibilidad de la técnica. Se demuestra también la detección simultánea de dos moléculas de distinta naturaleza (un miRNA y una proteína) en un ensayo inmunoenzimático. 4. Bibliografía [1] C. K. Dixit and R. M. Twyman, “Immunoassays | Clinical applications,” in Encyclopedia of Analytical Science, Elsevier, 2019, pp. 8–14. [2] J. L. Allinson, “Automated immunoassay equipment platforms for analytical support of pharmaceutical and biopharmaceutical development.,” Bioanalysis, vol. 3, no. 24, pp. 2803–2816, 2011, doi: 10.4155/bio.11.209. [3] R. J. Dinis-Oliveira, “Heterogeneous and homogeneous immunoassays for drug analysis,” Bioanalysis, vol. 6, no. 21, pp. 2877–2896, Nov. 2014, doi: 10.4155/bio.14.208. [4] A. N. Lee and I. R. Kennedy, “Immunoassays,” in Food Toxicants Analysis, Elsevier, 2007, pp. 91–145. [5] S. 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