The role of barrier to autointegration Factor BAF-1 in chromatin organization and premature ageing

Resumen

Los componentes nucleares tienen un comportamiento muy dinámico durante la progresión del ciclo celular y el desarrollo. En particular, la envuelta nuclear (EN) proporciona una barrera física entre los compartimentos nucleares y citoplasmáticos, controlando la intercomunicación a través del transporte nucleo-citoplasmático por los poros nucleares. Además, el papel de la EN controlando la actividad genómica y la organización cromosómica es cada día más evidente. Alteraciones en la estructura o componentes de la EN pueden dar lugar a un gran conjunto de enfermedades genéticas conocidas como laminopatías, que provocan disfunción tisular. Éstas incluyen un amplio rango de enfermedades como cardiomiopatía, distrofia muscular, afecciones neurológicas, lipodistrofia y envejecimiento prematuro. Dado que las proteínas relacionadas con laminopatías, como las láminas, emerina y BAF, se expresan de forma ubicua en todos los tipos celulares, es un reto entender cómo estas mutaciones resultan en fenotipos tejido específicos. Es posible que la organización nuclear en cada tejido lo haga más receptivo con respecto a otros a padecer los efectos de una mutación particular. En esta tesis nos centramos en la proteína nuclear BAF-1, el ortólogo en Caenorhabditis elegans de “Barrier to Autointegration Factor 1” que en humanos está codificado por el gen BANF1. BAF-1 es una proteína altamente conservada, con dominio de unión al ADN e implicada en la rotura de la envuelta nuclear, ensamblaje y reparación, así como en la compactación de la cromatina. Actúa en homodímero y se encuentra preferentemente en la EN, ya que su localización durante el ciclo celular es dependiente de lamina y de proteínas con dominio LEM (LAP2, emerina, MAN1 y otras) así como de la fosforilación por parte de VRK1. Sorprendentemente, la sustitución de un único aminoácido de BAF en la posición 12 (A12T) causa en humanos el síndrome progeroide de Nestor-Guillermo (NGPS). Esta enfermedad de envejecimiento prematuro afecta a una variedad de tejidos, provocando retraso en el crecimiento, defectos óseos y escoliosis. Debido a la similaritud entre las proteínas BAF humanas y de C. elegans, hemos modificado el locus endógeno de baf-1 para que mimeticemos en C. elegans la mutación causante de NGPS en humanos. El objetivo principal de mi tesis es caracterizar los fenotipos causados por la mutación G12T en el gusano a nivel de organismo, y también a escala celular. Esperamos que nuestra investigación contribuya a entender cómo una mutación en una proteína esencial que se expresa durante todo el desarrollo, desencadena la aparición de síntomas ~2 años después del nacimiento en pacientes humanos. Los resultados presentados en esta tesis están en proceso de ser publicados. En la primera sección de “Results” - “INTRODUCITION OF A PROGERIA LINKED MUTATION IN C. ELEGANS baf-1 PROVOKES MULTIPLE TEMPERATURE-DEPENDENT PHENOTYPES”- reportamos que la mutación baf-1(G12T) disminuye la Resistencia a estrés por calor y causa fenotipos dependientes de temperatura en la esperanza de vida, puesta de huevos y capacidad de fertilización. Los gusanos mutantes muestran, además, deformación de la EN, una característica típica del envejecimiento fisiológico, que se ve acelerado en los síndromes progeroides. En la sección “BAF-1(G12T) MUTATION DESTABILIZES ITS INTERACTION WITH LAMIN AND EMERIN IN C. ELEGANS” demostramos que BAF-1(G12T), al igual que el BAF-1 silvestre, se localiza preferentemente en la envuelta nuclear. Sin embargo, detectamos niveles de lamina y emerina reducidos en la EN en mutantes baf-1(G12T). Además, encontramos que estos mutantes son hipersensibles a perturbaciones en la EN, particularmente a aquellas afectando a lamina. La segregación cromosómica y la viabilidad embrionaria se ven dramáticamente afectadas por ello. En la sección “DNA INTERACTION CHANGES UPON baf-1 MUTATION” exploramos si la mutación causante de NGPS afecta la asociación de BAF-1 con la cromatina. Hemos determinado los perfiles de unión de las proteínas BAF-1 silvestre y mutante mediante la técnica del DamID tejido específica. En general, los perfiles de ambas proteínas son muy similares, pero además hemos identificado regiones concretas donde la asociación de BAF-1 está alterada y grandes diferencias en la asociación de BAF-1con el ADN entre los dos tejidos estudiados, hipodermis e intestino. Confirmamos mediante análisis de ontología génica que BAF-1 se asocial frecuentemente con genes involucrados en los procesos más afectados por la mutación baf-1(G12T). La penúltima sección, “FERTILITY IS AFFECTED UNDER NGPS MIMICKING MUTATION IN C. ELEGANS “, está dedicada al estudio de los defectos en la fertilidad en los mutantes baf-1(G12T). Una alta proporción de la puesta de estos mutantes consiste en oocitos sin fertilizar, lo que nos llevó a estudiar el desarrollo germinal, particularmente la espermatogénesis, donde vimos que BAF-1 se localiza en el esperma, pero no sus interactores, lamina y emerina, y que la mutación G12T afecta al proceso de espermatogénesis. Estas observaciones se hicieron en colaboración con el Dr. Jordan D Ward, donde estuve de visita durante tres meses en su grupo, en UCSC (California, EEUU). Gracias al conocimiento que he adquirido durante mi doctorado en el estudio de interacciones entre proteínas y la cromatina y con el uso de la bioinformática, he podidp participar en otros proyectos dentro del laboratorio, incluyendo colaboraciones internacionales con la Dr. S. Gasser del FMI en Suiza , donde hemos estudiado un modelo de C. elegans de la laminopatía “Emery-Dreifuss muscular dystrophy” (EDMD) causada por una mutación en lamina (LMN-Y59C). Hemos usado en C. elegans la técnica del DamID tejido específica en músculo, para monitorizar los efectos de esta mutación en la organización cromosómica. Fuimos capaces de suprimir los fenotipos asociados con la enfermedad muscular y rescatar las alteraciones en la organización cromatínica y transcripcional causada por la mutación LMN-Y95C mediante la combinación de la misma con la ablación de CEC-4, una proteína con dominios de unión a cromatina cuya función es anclar la cromatina metilada en H3K9 a la EN. Todo esto sugiere una nueva senda para las terapias de EDMD. En nuestra colaboración más reciente con la Dr. D. Larrieu del CIMR, en Cambridge (Reino Unido) hemos validado varios candidatos que alivian los fenotipos celulares en células inmortalizadas de pacientes de NGPS obtenidos en un escrutinio genético mediante CRISPR. Por último, he participado como primera autora en una publicación donde, entre otras técnicas, hemos desarrollado herramientas para aplicar de modo tejido específico la técnica de “RNA polymerase foot printing by DamID” (RAPID). Incluso hemos recapitulado los avances más recientes en el estudio de la organización nuclear en condiciones de estrés y envejecimiento en nuestra revisión y nuestra participación en el libro de protocolos “The Nuclear Pore Complex” , como primera autora de un capítulo donde describimos métodos para estudiar la función del complejo de poro nuclear en diferentes estadios del gusano mediante estrategias de visualización in vivo y etiquetado con proteínas fluorescentes, además de la optimización más reciente del protocolo de DamID tejido específico, útil para el estudio de la interacción de las nucleoporinas don el ADN. En conjunto, estos resultados muestran el impacto general de la mutación baf-1(G12T) pero también señala a procesos particulares, abriendo nuevas vías de investigación en la actualidad gracias a los descubrimientos hechos durante esta tesis.