ADN polimerasa mu (Pol µ), una enzima implicada en reparación y variabilidad del ADN

Resumen

El objetivo inicial de esta tesis doctoral fue la identificación de ADN polimerasas homólogas a la ADN polimerasa beta que participaran en procesos de reparación de ADN. Así, pudimos identificar una nueva ADN polimerasa humana perteneciente a la familia X a la que se denominó ADN polimerasa mu (Pol mu). Como el primer paso para poder demostrar que la Pol mu era efectivamente una ADN polimerasa, se llevó a cabo el clonaje de ADNc correspondiente al gen POLM humano para introducirlo en vectores de expresión de genes heterólogos en E.coli y sobreproducir proteína recombinante en grandes cantidades. Esta sobre-expresión, junto con un posterior proceso de purificación selectiva nos permitió obtener elevadas cantidades de Pol mu humana recombinante altamente purificada. Con esta proteína se pudo demostrar in vitro que la Pol mu es una ADN polimerasa. Tras la demostración de que la Pol mu humana recombinante posee actividad ADN polimerasa, se llevó a cabo una caracterización bioquímica detallada de esta enzima, determinando sus parámetros de eficiencia catalítica en las reacciones de síntesis, la afinidad por diferentes tipos de sustratos de ADN, la procesividad y la fidelidad de síntesis. En vista de los análisis preliminares, que indicabn que la Pol mu poseía una baja fidelidad de síntesis, llevamos a cabo un análisis exhaustivo de la capacidad de incorporación de errores por Pol mu (fenotipo mutador) en diferentes condiciones experimentales. De esta manera pudimos obtener información valiosa acerca de cúal es el mecanismo de acción de la Pol mu y cómo genera los errores de síntesis. Por otro lado, se llevó a cabo un análisis estructura-función de la Pol mu humana, con la finalidad de determinar posibles dominios funcionales y sitio/s activo/s de la enzima a lo largo de la estructura primaria de la proteína. Así se definieron una serie de resíduos aminocídicos supuestamente esenciales en lainterac