Toxicological risk assesment of mycotoxins and pumpkin extract exposure using omics and molecular techniques

Resumen

Las micotoxinas suponen un riesgo en seguridad alimentaria humana y animal ya que pueden contaminar una amplia gama de alimentos y piensos. El objetivo general de la tesis es la evaluación in vitro de los efectos tóxicos a nivel molecular producidos por micotoxinas y aportar información sobre sus mecanismos de acción. Se comenzó con el estudio de las variantes de un solo nucleótido (SNVs) empleando datos transcriptómicos obtenidos por secuenciación masiva de ARN de células Jurkat expuestas individualmente a beauvericina (BEA) y enniatina B. Los dos protocolos de descubrimiento de SNVs mostraron resultados muy diferentes e incluso se encontraron SNVs manualmente. Los resultados de la expresión génica diferencial (DEGs) del análisis transcriptómico también se compararon con los obtenidos en estudios anteriores mostrando DEGs comparables pero no idénticos: sólo 2 DEGs superpuestos de BEA frente a los 43 DEGs publicados y 354 DEGs superpuestos de ENB, con 147 coincidencias respecto a los 245 DEGs encontrados en los resultados anteriores. En el análisis proteómico de extractos de mitocondrias enriquecidos provenientes de células Jurkat expuestas durante 24 h a BEA:EN B, se identificaron y cuantificaron 340 proteínas (59 mitocondriales) alteradas de forma estadísticamente significativa. La exposición indujo cambios dependientes de la concentración en los niveles de proteínas mitocondriales que implican principalmente a los complejos de la membrana interna y externa, la cadena de transporte de electrones (CTE) y los ribosomas. Estos resultados señalaron daño en la fosforilación oxidativa, el metabolismo y las rutas de señalización relacionadas con enfermedades neurodegenerativas. Algunas micotoxinas como BEA, ocratoxina A (OTA) y zearalenona (ZEA) pueden atravesar la barrera hematoencefálica (BHE). La acción antiinflamatoria de un extracto de calabaza procedente de la pulpa de Coucourbitaceous maxima (var. Delica) se analizó frente a estas micotoxinas y sus combinaciones (OTA+ZEA y OTA+ZEA+BEA) en un modelo de BHE con células ECV304 diferenciadas, tras dos horas de exposición. El metabolito proinflamatorio eoxina (14,15-LTE4) de la vía del ácido araquidónico mostró una menor abundancia en las muestras de ZEA y BEA+OTA+ZEA y extracto de calabaza que en las exposiciones a micotoxinas sin extracto de calabaza. Otro marcador de inflamación, el éster de prostaglandina D2-glicerol, sólo se encontró en los cultivos tratados con OTA+ZEA y BEA+OTA+ZEA, pero no en los que se incluía el extracto de calabaza. Además, la concentración del metabolito del extracto de calabaza dihidromorflavona disminuyó significativamente en presencia de micotoxinas. Por tanto, el extracto de calabaza mostró una actividad protectora contra la inflamación celular desencadenada por las micotoxinas. Se estableció un enfoque transcripcional utilizando células ECV304 diferenciadas. Las micotoxinas elegidas fueron las aflatoxinas (AFs) y las ENs. Se utilizaron las mismas que concentraciones que en el estudio metabolómico. Se analizó la expresión relativa de 13 genes relacionados con la mitocondria. Incluso a bajas concentraciones, la actividad del extracto de calabaza sobre la expresión de los genes mitocondriales provocó un efecto beneficioso y, para la mayoría de los genes estudiados a través de la CTE, desarrolló un efecto protector cuando se mezcló con AFs o ENs. Se amplió el estudio transcripcional a la exposición de BEA, ENs, ZEA y OTA más extracto de calabaza, solas o combinadas. Estos genes relacionados con la CTE y la actividad mitocondrial se encontraron sobreexpresados en las exposiciones que incluían micotoxinas más extracto de calabaza frente a las de micotoxinas individuales. La exposición a BEA y BEA+ENs redujo significativamente la expresión génica del Complejo I y la adición de calabaza revirtió el efecto. El Complejo IV fue la estructura más regulada a nivel génico de la CTE para todas las condiciones. La generación intracelular de ROS fue dependiente de la condición y mostró una alta variabilidad. En conjunto, los datos confirman que los procesos mitocondriales en la BHE podrían verse comprometidos por la exposición a micotoxinas y el daño podría ser modulado por antioxidantes dietéticos como los carotenoides. Se puede concluir que las técnicas ómicas suponen un cambio de paradigma en el estudio de riesgos toxicológicos de exposición a contaminantes, por lo que es necesario seguir profundizando en los conocimientos que aportan para aumentar la prevención redundando en una mayor seguridad alimentaria.