Aplicación a cepas industriales de saccharomyces de herramientas de genética molecular para su caracterización, identificación y mejora orientada a la producción de treonina y otros metabolitos relacionados

Resumen

El objetivo central de esta Tesis ha sido la obtención mediante manipulación genética, de levaduras industriales superproductoras del aminoácido treonina y de aminoácidos azufrados. Para ello, se disponía del alelo HOM3-R2, que había sido aislado en el laboratorio donde se ha realizado esta Tesis, a partir de cepas mutantes de Sacccharomyces cerevisiae que acumulaban hasta 20 veces más treonina que una cepa silvestre. Este alelo determina una aspartato quinasa insensible a retroinhibición por treonina. La enzima aspartato quinasa es la primera enzima en la ruta de síntesis de este aminoácido y ejerce el control fundamental del flujo de metabolitos a través de esta ruta. Además, de esta ruta deriva la de síntesis de los aminoácidos azufrados metionina y cisteína, fundamentales también para la obtención de biomasas ricas en aminoácidos que podrían utilizarse como suplemento de piensos para animales. Los aspectos desarrollados en esta Tesis han sido los siguientes: 1) Obtención de cepas de levadura enriquecidas en aminoácidos azufrados El objetivo de esta parte del trabajo era tratar de, a partir de una cepa de laboratorio de S. cerevisiae, obtener cepas superproductoras de metionina y/o cisteína. Para ello se han construido cepas con el alelo HOM3-R2 y combinaciones de distintos alelos de genes de la ruta: los alelos mutantes MET30-2, sam2 y thr1-011, y el alelo silvestre de MET25 amplificado en un plásmido multicopia. También se obtuvieron mutantes resistentes a etionina, un análogo tóxico de la metionina. Los resultados indican que la ruta específica de los aminoácidos azufrados está fuertemente regulada de modo que, aunque se logró redirigir el flujo de metabolitos de la ruta de la treonina hacia la de estos aminoácidos, ninguna de las combinaciones alélicas daba lugar a un aumento significativo de las cantidades de ellos. El resultado mas esperanzador se obtuvo con los mutantes resistentes a etionina, en un fondo thr1 011 HOM3 R2, que acumulaban hasta 20 nmoles /mg de peso seco, frente a cantidades casi indetectables de la cepa original. 2) Caracterización e identificación de cepas de levadura empleadas en cervecería y superproducción de treonina en estas cepas En primer lugar, se procedió a la caracterización molecular (ploidía y origen de sus genomas nuclear y mitocondrial) de algunas cepas utilizadas por Heineken España para la fabricación de cerveza, lo que puede ser útil para su identificación en cualquier momento del proceso. Habitualmente, la biomasa de desecho de cervecería se utiliza como suplemento de piensos, si bien esta biomasa es bastante pobre en treonina. Con el fin de conferir a la capacidad de superproducir treonina a cepas cerveceras, se han construido cepas que portaban el alelo HOM3-R2 y en las que se había interrumpido al menos una copia del gen CHA1, implicado en la degradación de treonina. Efectivamente, estas construcciones superproducían este aminoácido sin que su presencia afectara significativamente a la evolución de la fermentación ni a la vitalidad de la cepa. Adicionalmente, se ha diseñado una construcción portadora del alelo HOM3-R2 para integrar y estabilizar dicho alelo en el genoma; se ha demostrado su funcionalidad en cepas genéticas. Como aspecto novedoso de este apartado, se han obtenido mediante mutagénesis in vitro variantes alélicas de HOM3 diseñadas para servir de ¿etiquetas moleculares¿ que, introducidas en una cepa en particular, permitirían su identificación unívoca. 3) Obtención de biomasa de levadura enriquecida en aminoácidos esenciales a partir de la cepa AlcoFreeTM Se ha estudiado el efecto de la introducción del alelo HOM3-R2 en la levadura industrial de diseño AlcoFreeTM. Esta levadura, en presencia de oxígeno, posee un metabolismo exclusivamente respiratorio incluso cuando existen altas concentraciones de glucosa en el medio, por lo que es más eficiente en la producción de energía y biomasa. Este estudio se ha completado mediante ensayos de producción de aminoácidos en biorreactores. Con esta cepa se han alcanzado los máximos valores de treonina (1200 nmoles/mg de peso seco), e incluso de metionina (unos 20 nmoles/ mg de peso seco), y niveles muy altos de otros aminoácidos, lo que resulta altamente interesante para su futuro uso en el campo de la biomasa enriquecida.