Caracterización bioquímica, molecular y celular de la ß-glucosidasa de olivo y su relación con la composición fenólica del aceite de oliva virgen

Resumen

El aceite de oliva virgen (AOV), la grasa mayoritaria de la dieta mediterránea, es un zumo natural de excepcionales propiedades organolépticas con demostrados efectos beneficiosos sobre la salud. El perfil metabólico del AOV responsable de su calidad nutricional, organoléptica y tecnológica está determinado por el nivel de ciertos componentes que pasan directamente del fruto al aceite, como los ácidos grasos, y por el nivel de otros componentes que se forman específicamente durante el proceso industrial de obtención del aceite a partir de precursores presentes en el fruto por acción de distintas enzimas, siendo este el caso de los compuestos volátiles y fenólicos. El contenido final de estos metabolitos relacionados con la calidad del AOV está controlado por los niveles de expresión/actividad de los correspondientes genes/enzimas implicados en su biosíntesis que dependen de la variedad de olivo. Sin embargo, la caracterización de variedades de olivo se ha realizado tradicionalmente en base a criterios puramente agronómicos sin que exista un estudio sistemático dedicado a la identificación de marcadores directamente relacionados con calidad de aceite. El conocimiento de las propiedades cinéticas y mecanismos de regulación de los genes y enzimas relacionados con la síntesis de los metabolitos que determinan la calidad del AOV permitiría establecer estrategias de control para optimizar dicha calidad, tanto en el campo tecnológico como en programas de mejora. Desde el punto de vista tecnológico, podrían desarrollarse nuevos aceites de oliva con características de calidad específicas mediante la modulación de los correspondientes procesos bioquímicos activos durante su extracción. Por otra parte, la identificación de los genes/enzimas más importantes en relación con la calidad del aceite y el conocimiento de su regulación pueden ser utilizados en la selección asistida por marcadores moleculares de clones de olivo con características de calidad de aceite mejorada. En este sentido, el objetivo general de la propuesta es la identificación de determinantes bioquímicos y moleculares implicados en la síntesis de los compuestos que determinan la calidad organoléptica, nutricional y tecnológica del AOV. En relación a la formación de compuestos secoiridoideos, los principales compuestos fenólicos del AOV, en estudios previos se ha aislado y purificado a aparente homogeneidad, una enzima ß-glucosidasa (BGLC) en pulpa de aceituna que exhibe una potente actividad frente al principal glucósido fenólico de la aceituna, la oleuropeína. Los datos de actividad BGLC a lo largo de la maduración de distintas variedades de aceituna guardan buena relación con la composición fenólica de aceites procedentes de frutos con distinto grado de maduración. La BGLC desempeña un papel crucial en la transformación de los glucósidos fenólicos del fruto generando distintos derivados secoiridoideos a partir de sus correspondientes agluconas, que gracias a su carácter anfipático son transferidos al AOV. Aunque en estudios anteriores realizados en nuestro grupo se ha clonado un gen BGLC de olivo (OepBGLC1), hasta la fecha, no se ha realizado una caracterización bioquímica, molecular y celular de las distintas isoenzimas y genes BGLC de olivo. El presente trabajo de investigación se ha centrado en la identificación y caracterización de genes e isoenzimas BGLC de aceituna que participan en la transformación de los compuestos fenólicos del AOV, así como el estudio de su regulación transcripcional y función fisiológica. Para conocer qué genes de los que se expresan en el mesocarpo del fruto tienen niveles de expresión relativamente altos como para repercutir en la composición fenólica del AOV, se realizó una búsqueda en la base de datos de ESTs generada en el proyecto OLEAGEN. Con los datos obtenidos se realizó la clonación de los cDNAs correspondientes a tres nuevos genes BGLCs de olivo: OepBGLC2, OepBGLC3 y OepBGLC4, cuyas secuencias codificantes mostraron tener altos niveles de similitud con otras BGLCs conocidas de plantas. Los análisis filogenéticos mostraron que las secuencias de proteínas que codifican los tres nuevos genes clonados estaban evolutivamente muy próximas entre sí, mientras que la isoenzima OepBGLC1 quedó agrupada en otra región del dendrograma. Para establecer la identidad funcional de los cuatro genes BGLC de olivo, se expresaron heterólogamente empleando dos sistemas de expresión diferentes, uno basado en el microorganismo Escherichia coli y otro basado en la planta Nicotiana benthamiana. Los ensayos de inmunodetección realizados con las proteínas recombinantes mediante western blot desvelaron que la única isoenzima que estaba presente en la preparación purificada de BGLC obtenida a partir de mesocarpo de aceituna era OepBGLC1, hecho que posteriormente se corroboró al demostrar la capacidad de la isoenzima recombinante OepBGLC1 para hidrolizar los principales compuestos fenólicos de la aceituna y que, por tanto, esta isoenzima es al menos una de las responsables del contenido fenólico del AOV. No pudo establecerse la identidad funcional del resto de isoenzimas recombinantes. La isoenzima recombinante OepBGLC1 presentó actividad BGLC frente a los principales compuestos secoiridoideos del mesocarpo de la aceituna, mostrando una clara preferencia por el glucósido fenólico mayoritario, la oleuropeína, y demostrando tener capacidad hidrolítica sobre el principal compuesto fenólico de la semilla, el nuzhénido. Sin embargo, posiblemente debido a las modificaciones inherentes al propio sistema de expresión, el comportamiento cinético con respecto a la enzima nativa fue diferente, aunque sí presentara el mismo pH óptimo, la misma temperatura óptima y la misma resistencia térmica. La isoenzima OepBGLC1 se encuentra localizada subcelularmente en el núcleo y los glucósidos fenólicos en la vacuola, de forma que sólo cuando se produce la lisis celular se ponen en contacto la isoenzima y los sustratos dando lugar a los derivados secoiridoideos que forman parte del mecanismo de defensa natural del olivo frente a patógenos y depredadores, y que son los principales compuestos fenólicos del AOV. Las isoenzimas OepBGLC2 y OepBGLC4 presentaron una localización subcelular apoplástica, siendo secretadas al exterior celular vía retículo endoplasmático. La localización de OepBGLC3 no pudo establecerse claramente, pudiéndose localizar en cuerpos proteicos, en cuerpos del retículo endoplasmático o tener simplemente una localización errónea. Los análisis de expresión de los genes OepBGLC2, OepBGLC3 y OepBGLC4 de olivo en distintos tejidos y a lo largo del desarrollo y la maduración de la aceituna pusieron de manifiesto que estaban regulados de forma espacial y temporal. La temperatura regula la transcripción de los genes OepBGLC2, OepBGLC3 y OepBGLC4, provocando una inducción de todos los genes a temperatura baja en ambas variedades. En el caso de la temperatura alta, mientras que no produjo efectos en la variedad Picual, en la variedad Arbequina provocó la represión de los tres genes. La oscuridad y la herida provocaron una disminución de la expresión de todos los genes BGLC estudiados. El riego deficitario incrementó los niveles de expresión de los genes OepBGLC1, OepBGLC3 y OepBGLC4 tras la maduración de los frutos, lo que podría explicar el mayor contenido de derivados secoiridoideos de los aceites procedentes de frutos que han sufrido déficit hídrico. Además, la inducción de los genes OepBGLC3 y OepBGLC4 en condiciones de estrés hídrico podría relacionarlas con la regulación de los niveles de ABA. Para profundizar en el conocimiento del papel que juegan las BGLCs de olivo en las diferencias varietales de los AOVs, se realizaron estudios bioquímicos y moleculares con aceitunas de las variedades Menya y Shengeh que dar lugar a aceites con un contenido fenólico muy elevado y muy escaso, respectivamente. Los niveles de glucósidos fenólicos de la variedad Menya son muy superiores a los de la variedad Shengeh, al igual que el contenido en derivados secoiridoideos de sus aceites. Tanto el contenido fenólico de los frutos como el nivel de actividad BGLC detectado explican las enormes diferencias encontradas en los perfiles fenólicos de ambas variedades, aunque en este caso los estudios de expresión no aporten datos concluyentes.