Estrategias de uso de Saccharomyces cerevisiae en fermentaciones aeróbicas

Résumé

El vino es un alimento tradicional, especialmente en los países del área mediterránea donde su producción se remonta a las primeras poblaciones humanas. España alberga el primer viñedo a escala mundial, con un 13% de la superficie de cultivo total de vid destinada a la producción de vino (datos de 2021, disponibles en www.fev.es/sector-cifras/), lo que se traduce en una aportación del 2.2% del valor añadido bruto y en el mantenimiento del 2.4% de empleo en España entre puestos de trabajo directos e indirectos (Analistas Financieros Internacionales, 2020). El sector vitivinícola está presente en todas las comunidades autónomas españolas, siendo una importante fuente de ingresos para las zonas rurales, actuando como un dinamizador del territorio y colaborando con el reto del despoblamiento territorial, bien gracias a la producción directa de vino, a la presencia de industrias accesorias (maderera, industria del corcho, del vidrio y otras) o mediante el enoturismo (Analistas Financieros Internacionales, 2020). En los últimos años se ha observado un incremento sin precedentes de las temperaturas en la superficie terrestre (NOAA Global Climate Report for 2020), acompañado de cambios en el nivel y distribución de las precipitaciones. Este contexto de cambio climático está afectando a gran número de cultivos, especialmente en las regiones más secas como el área mediterránea. En el caso concreto de la vid, cultivo típico de estas zonas, se ha observado un claro cambio en el patrón de maduración de las bayas debido a estas alteraciones climáticas. En las últimas décadas se ha visto un desfase cada vez mayor entre la acumulación de azúcares dentro de la baya (madurez tecnológica) y la madurez organoléptica debida a la acumulación de compuestos fenólicos y aromáticos (Jones y Webb, 2010; Holland y Smith, 2010; Keller, 2010; Mira de Orduña, 2010). A causa de este desfase, lograr la producción de un vino con suficiente calidad organoléptica para el consumidor supone retrasar la vendimia más allá del punto óptimo de concentración de azúcares. Este aumento de azúcares se traduce, por el propio proceso de fermentación, en un incremento en la concentración de etanol y, por tanto, en un aumento en la graduación alcohólica del vino. Se estima que desde 1980 los vinos comerciales han aumentado su contenido alcohólico en un 1% cada década, observándose este patrón de aumento en todo tipo de vinos y áreas de producción (Jones et al., 2005; van Leeuwen y Darriet, 2015), con una tendencia aún más severa en las regiones más cálidas, tradicionalmente de mayor producción vitivinícola (Alston et al., 2011; Godden et al., 2015). El aumento del contenido alcohólico supone un grave problema para la industria vitivinícola desde varios puntos de vista: Grandes concentraciones de etanol pueden alterar el proceso de elaboración, al evitar que tanto levaduras (fermentación alcohólica) como bacterias del ácido láctico (fermentación maloláctica) se desarrollen de manera óptima (Bisson, 1999; Bruescher et al.,2001; Coulter et al., 2008; Graça da Silveira et al., 2002) dando lugar a paradas fermentativas y/o defectos organolépticos. Aunque el proceso de elaboración se llegase a completar, un exceso de grado alcohólico genera un desequilibrio sensorial al aumentar la solubilidad de ciertos compuestos volátiles, impidiendo su percepción (Goldner et al., 2009; Pickering et al., 1998; Hartmann et al., 2002; Le Berre et al., 2007; Robinson et al., 2009). Además, la sociedad actual busca cada vez más un estilo de vida saludable y un consumo de alcohol moderado, de forma que bebidas de alta graduación tienen cada vez menos cabida en el mercado (Schmidtke et al., 2012; Saliba et al., 2013), existiendo incluso medidas de salud pública que gravan la comercialización internacional de bebidas de alta graduación y que podrían llegar a afectar a la exportación-importación de vino (de Barros Lopes et al., 2003; Contreras et al., 2014). Existen numerosos abordajes para tratar de paliar este problema, desde el manejo del cultivo para evitar el desfase en la maduración (por ejemplo, deshojado, manejo del suelo o deslocalización de cultivos) (Stoll et al., 2010; Whiting, 2010; Schmidtke et al., 2011; Ozturk y Anli, 2014) hasta la desalcoholización del vino mediante sistemas de filtración y evaporación, que exigen una posterior reestructuración del vino (Akyereko et al., 2021; Catarino y Mendes, 2011; Labanda et al., 2009; Gonçalves et al., 2013; Diban et al., 2008; Fedrizzi et al., 2014), pasando por la eliminación de parte del contenido en azúcares del mosto mediante dilución, filtración o tratamientos enzimáticos (Pickering et al., 1998; 1999). Todos ellos presentan ventajas e inconvenientes, siendo en la mayoría de los casos abordajes difíciles de implementar a nivel industrial, que supondrían un elevado sobrecoste, o que podrían tener un impacto negativo en la percepción del consumidor. No obstante, algunos de estos abordajes son soluciones válidas que están siendo investigadas y optimizadas para su transferencia al sector industrial. En esta tesis doctoral se presenta como posible solución al aumento de grado alcohólico el abordaje del problema desde un punto de vista microbiológico, modificando el proceso de fermentación alcohólica. Este enfoque apuesta por reducir el rendimiento de etanol de las levaduras con el objetivo de modificar al mínimo el producto final. Puede llevarse a cabo mediante dos líneas principales: la modificación del rendimiento en etanol de Saccharomyces cerevisiae y/o la utilización de levaduras alternativas al género Saccharomyces. S. cerevisiae es un organismo altamente especializado en la fermentación alcohólica, siendo su agente principal y existiendo cepas adaptadas específicamente a la fermentación del mosto de uva (cepas vínicas), (Liti et al., 2009; Peter et al., 2018). Estas cepas presentan una gran tolerancia a los factores de estrés propios del medio enológico, como gran tolerancia a grandes concentraciones de azúcares (alta presión osmótica) bajo pH, altas presiones, presencia de sulfito (SO32-), amplio rango de temperaturas y una alta resistencia a la toxicidad del etanol, que producen en grandes cantidades. Esta combinación de características hace que S. cerevisiae sea capaz de desbancar al resto de la microbiota presente en el mosto muy rápidamente conforme se inicia la fermentación, aun cuando esté en una proporción muy baja inicialmente. Esta especialización, que hace de S. cerevisiae el organismo fermentador por antonomasia, dificulta enormemente la modificación de su rendimiento en etanol, que además de ser más alto que el que presentan otras especies es una característica enormemente homogénea en toda la especie, como se describe en el capítulo 1. Por otro lado, existen multitud de especies de levadura con un perfil de fermentación más adecuado para el objetivo de un menor rendimiento alcohólico. Sin embargo, estas especies, aun cuando sobreviven durante las fases iniciales de la fermentación, acaban siendo desplazadas por S. cerevisiae, precisamente por su menor adaptación a la fermentación del mosto, haciéndose necesario un trabajo de mejora para aumentar su resistencia a factores de estrés tan cruciales como la presencia de sulfito (SO32-), temperatura o pH bajo. En esta tesis doctoral se propone el uso de S. cerevisiae para reducir el grado alcohólico del vino mediante la desviación del consumo de azúcares de la producción de etanol hacia la generación de CO2 mediante la capacidad respiratoria de las levaduras. En concreto, se pretende solventar mediante distintas aproximaciones un problema inherente a esta propuesta, el exceso de producción de ácido acético por parte de S. cerevisiae en las condiciones de cultivo necesarias para que tenga lugar la respiración (aerobiosis). En este trabajo se explora la diversidad natural de S. cerevisiae en busca de cepas con una menor producción en ácido acético, identificando posibles cepas candidatas para su aplicación industrial, y se pone a punto el proceso de aireación para una cepa seleccionada (capítulo 1). Se aborda el estudio de la relación entre la flexibilización de la represión por catabolito (capacidad de consumir otros azúcares en presencia de glucosa) y la menor producción de ácido acético, que sirve de base para el diseño de una evolución dirigida con el objetivo de obtener cepas con baja producción de ácido acético en aerobiosis (capítulo 2). Finalmente, se explora la reducción de ácido acético por medio de la regulación de las condiciones de aerobiosis, no mediante el control del flujo de aire, sino gracias al consumo de oxígeno por parte de la levadura alternativa Metschnikowia pulcherrima (capítulo 3).